Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒
包裝規(guī)格
產品貨號：An0020、An0050、An0100
規(guī)格：20T、50T、100T
儲存條件
4oC保存，一年有效
產品介紹：
磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜 PS由脂膜內側翻向細胞膜外側，使PS暴露在細胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結 合。因此Annexin V被*為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。
Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒將Annexin V進行綠色熒光（FITC）標記，以標記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀 可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完 整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
圖 1. 細胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖
試劑盒組份：
所需實驗器材：
微量移液器；PBS；不含 EDTA 的胰酶消化液；低速離心機；流式細胞儀
注意事項：
1. 此試劑盒僅供研究使用。
2. 微量試劑需離心數秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。
3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
4. Annexin V-FITC 中含有毒成分三氮化鈉（NaN3）, 操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
5. 本試劑盒用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于 1x106。
6. 染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。
7. Annixin V 檢測凋亡細胞的方法適用于懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長的細胞，由于 在胰酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響 檢測，可將胰酶消化后的細胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防止進一步的損傷。盡管目前，包括國外也有一些單 位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復性較差，且需要操作時非常小心。
8. 消化貼壁細胞殘留的胰酶會消化并降解 Annexin V-FITC，最終導致染色失敗。
9. 細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。
操作說明：
1. 細胞樣品的準備：
a) 懸浮細胞：
1）收集細胞至離心管中 1000-2000rpm 離心 5min，小心去除上清。
2）用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。
3）再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。
b) 貼壁細胞：
1）吸出細胞培養(yǎng)液至離心管中，PBS 洗滌貼壁細胞一次，加入適量不含 EDTA 的胰酶細胞消化液消化細胞。
2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
3）加入以上步驟中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉移到離心管內，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。 注：加入的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可 以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的 Annexin V-FITC 導致染色失敗。
4）用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。
5）再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。
2. 用去離子水按 1：4 稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離子水）；
3. 用 250?l 結合緩沖液重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為 1×106/ml；
4. 取 100?l 的細胞懸液于 5 ml 流式管中，加入 5?l Annexin V-FITC，輕輕混勻；
5. 室溫(20-25oC)避光孵育 10min；
6. 上機前 5min 加入 10?l 碘化丙啶溶液，輕輕混勻；
7. 上機前在反應管中補加 400?l PBS 重懸細胞， 避光保存，隨即進行流式細胞儀（FACS）檢測， Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。
圖 2. 流式細胞儀檢測早期凋亡細胞。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞
