2.建議使用高保真酶進行目的片段的 PCR 擴增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。

載體線性化

1.雙酶切：同時選擇兩種限制性內(nèi)切酶對載體質(zhì)粒進行線性化處理。內(nèi)切酶選擇可參考第二章第一節(jié)內(nèi)容；

3.反向 PCR 擴增：以載體質(zhì)粒為模板，以 PCR 擴增形式進行線性化。建議使用高保真酶擴增，降低突變引入，且模板質(zhì)粒投入量不宜過多（50μl 投入 1ng），并使用 DpnI 對擴增產(chǎn)物消化。

目的片段和線性化載體的純化回收

2.推薦使用切膠回收的方式純化（切膠時間最好控制在 3min 內(nèi)，避免紫外照射對 DNA 的傷），回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測，濃度應(yīng)當(dāng)≥ 20ng/μl，并跑膠鑒定是否為單一目的條帶；

3.回收濃度低時，可通過增加 PCR/ 酶切反應(yīng)體系，采取多管反應(yīng)單管回收的方式，提高回收產(chǎn)物的濃度。

目的片段與線性化載體連接重組

1.連接反應(yīng)體系按照說明書要求計算投入量，體系中各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過高可稀釋后使用；

感受態(tài)轉(zhuǎn)化涂板

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞選擇使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學(xué)感受態(tài)細胞；
2. 感受態(tài)細胞不可反復(fù)凍融使用，-80°C取出后建議一次用完；
3. 重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)
細胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細胞；
4. 熱激時間：按照感受態(tài)細胞說明書操作進行；
5. 平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致；
6. 菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g、3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留
100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。

單克隆菌落PCR鑒定
1. 挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過大或過小的單克隆菌落；
2. 挑取數(shù)個單克隆菌落進行鑒定分析；
3. 挑取的菌落放入已添加 10μl ddH 2 O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后，吸取 1-2μl 作為
PCR 反應(yīng)（10/20μl 體系）模板；

4. 推薦使用一對分別位于片段和載體的上下游引物進行 PCR 鑒定。

常見問題分析：
不長克隆
1. 引物同源臂設(shè)計錯誤：長度（不計算酶切位點）應(yīng)為 15-20bp 之間，過長過短均影響重組效率；GC 含量以 40-60% 之間最適，超出范圍會影響重組效率。建議使用 CE Design 在線設(shè)計；
2. 重組反應(yīng)體系不符合要求：片段和線性化載體的總長度不應(yīng)超過 20kb，應(yīng)當(dāng)切膠回收且回收濃度不低于 20ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl；投入量按
照下表公式計算：

3. 連接反應(yīng)不適當(dāng)：反應(yīng)應(yīng)在 PCR 儀中進行，溫度、時間設(shè)置按照說明書進行，當(dāng)同源臂GC 含量超過 60% 或連接片段數(shù)較多時，可延長至 30min，其中 C112/C113 可將溫度時間改為 50°C 15min；
4. 陽性對照反應(yīng)：使用試劑盒中提供的線性化載體和插入片段，按說明書配制重組反應(yīng)體系，以排除其他實驗材料及操作因素的影響；
5. 轉(zhuǎn)化涂板操作不當(dāng)：感受態(tài)細胞應(yīng)選用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學(xué)感受態(tài)細胞，不可使用電擊感受態(tài)細胞；重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)體積的比例為 1:10；熱激時間按照感受態(tài)細胞說明書操作；平板使用抗性與載體抗性保持一致；涂板前將菌液離心（2500×g，3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留100μl 重懸后全部涂板。

假陽性；

引物同源臂設(shè)計錯誤：長度（不計算酶切位點）應(yīng)為 15-20bp 之間，過長過短均影響重組效率；
GC 含量以 40-60% 之間最適，超出范圍影響重組效率。建議使用 CE Design 在線設(shè)計；
2. 目的片段 PCR 擴增模板質(zhì)粒殘留：若目的片段擴增自質(zhì)粒模板，且質(zhì)粒抗性與載體抗性一致時，應(yīng)當(dāng)降低質(zhì)粒模板投入量（50μl 體系使用 1ng 質(zhì)粒），擴增后使用 DpnI 消化并切膠回收；
3. 線性化載體產(chǎn)物原始質(zhì)粒殘留：若使用酶切方式線性化載體，使用跑膠鑒定部分酶切（酶切前后質(zhì)粒同時對比），部分酶切時需調(diào)整酶切方案（參考第二章第一節(jié)內(nèi)容），酶切產(chǎn)物應(yīng)切膠回收；若通過 PCR 反向擴增線性化載體，應(yīng)當(dāng)降低質(zhì)粒模板投入量（50μl 體系使用 1ng 質(zhì)粒），擴增后使用 DpnI 消化并切膠回收；
4. 重組反應(yīng)體系不符合要求：片段和線性化載體的總長度不應(yīng)超過 20kb，應(yīng)當(dāng)切膠回收且回收濃度不低于 20ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl；投入量按照下表公式計算。

測序突變

5. 平板抗性失效：平板使用抗性與載體抗性保持一致，并確認抗生素工作液濃度和有效期（一測序突變1.測序克隆數(shù)過少：測序克隆數(shù)只有 1 個時，測序信息部分可信，建議多測幾個單克隆，檢查突變處的測序信號是否有問題，分析突變是否從模板引入；
2. 突變位置：若堿基突變位于引物處，建議重新合成引物再次實驗；位于其他部位的突變，應(yīng)當(dāng)使用高保真酶重新制備模板再次實驗。

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