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如何提高DNA濃度/純度測定的準確性？
發布時間： 2024-04-23 點擊次數： 1265次分子生物學實驗中經常需要對樣品進行濃度和純度的測定，它相當于一種質控，以此來確保下游實驗的結果可靠。
常用的DNA濃度/純度測定設備是紫外分光光度計，它的原理是利用物質分子對紫外可見光譜區的輻射吸收來進行分析物質成分。
這樣來描述可能有點生硬，我們舉個栗子：
假設現在有一樣物質A，它溶解在溶液內，當光照射溶液時，溶液內的A會吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長，A對不同顏色的光（不同波長）的吸收程度是不一樣的。
雙鏈的DNA，它能對波長為260nm的光進行強烈的吸收，吸收的程度可以用一個叫吸光度的數值來測量，濃度越高的DNA，理論上吸光度也越高。
最后，通過與標準品的吸光度數值對比后，就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。
DNA濃度測定通常會使用紫外分光光度計，常見的有NanoDrop這類設備。除了DNA，它還能測定RNA和蛋白的吸光度。
要提高濃度測定的準確性，需要注意以下幾點：
檢測之前，務必充分混勻DNA溶液，因為這類機器的上樣檢測體積只需要1-2uL，如果樣品沒有混勻，那么每次檢測樣品濃度也會不一樣。
因為上樣體積很小，所以樣品很容易揮發，如果把樣品加在檢測基座后不馬上檢測的話，會導致測出來的樣品濃度偏高。
實驗環境和耗材的穩定性要高。檢測設備應該在放置在溫度可控、通風的環境下；裝樣品的管子如果不是要進行吸取樣品操作的話，需要時刻緊閉。
每次檢測完畢，都需要對檢測基座或者比色皿進行清洗和擦拭，確保不會有樣品殘留后，再進行下一次上樣檢測。
空白調零，應該使用溶解待檢測樣品的溶液來調零。例如如果用水溶解DNA，那就用水調零，用其他緩沖液溶解，則用對應的緩沖液調零。
在測定后，我們通常會看到，設備會提供幾個不同的結果給我們，有的是數值，例如OD230、OD260，有的是比值，例如OD260:280，那這些結果代表什么呢？
OD是optical density(光密度)的縮寫,表示被檢測物吸收的光密度。
OD=lg(1/trans)，其中trans為被測物質的透光值。
不同的OD以及OD比值，代表不同的意義：
【OD230】
提取核酸時會用到各種化合物，它們以鹽離子的形式存在，例如胍鹽、苯氧基離子、硫氰酸酯。
這些鹽離子對230nm波長的紫外光有強烈的吸收值。如果測定核酸時，發現OD230數值很高，代表溶液中的鹽離子濃度很高。
【OD260】
雙鏈DNA在這個波長下會對光有強烈的吸收。
【OD280】
芳香族氨基酸在這個波長下，有強烈的光吸收。如果該數值很高，代表DNA溶液中可能存在蛋白質的污染.
【OD320】
通常是由光散射造成的。如果該數值很高，意味著溶液內有顆粒物污染、待檢器皿例如比色皿有污漬。
【OD260:OD280】
通常用于判斷DNA或RNA溶液的純度。常用的指標是：在OD230數值較低，OD320數值較低的前提下。較高純度的DNA，比值應該為1.7～1.9之間，較高純度的RNA，比值應該為1.9～2.0之間。
當然，以上測定的結果并非是絕對計數的數值，它是一個參考數值，因為我們在測定時是不涉及用到標準品這樣東西，所以，也就是我們測出來的數可以作為一定程度的參考。
而且，當一些外界因素影響時，測定也會出現偏差，例如樣本含量非常非常低時，測定的數值誤差就會很高并不具參考意義，設備耗材出現問題時，測定的數值也會不準。
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