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永生化人腦微血管內皮細胞（HCMEC/D3）培養(yǎng)指南
發(fā)布時間： 2024-02-19 點擊次數(shù)： 1214次簡介：
HCMEC/D3細胞系來自于癲癇患者手術切除的富含腦內皮細胞（CECs）的組織，并從中分離出人顳葉微血管。后續(xù)使用人端粒酶（hTERT）和SV40大T抗原的催化亞基通過慢病毒載體轉導，使細胞依次永生化后，通過有限稀釋克隆法選擇性分離CEC，最終鑒定所得的細胞，具有廣泛的腦內皮細胞表型特征。可表達大量內皮細胞；可在基質膠上形成毛細血管樣結構；可作為人血腦屏障（BBB）模型。可用于研究內皮細胞，血管，藥物攝取與主動轉運機制等。
培養(yǎng)條件：
內皮細胞專用基礎培養(yǎng)基-EMC培養(yǎng)基+5%FBS+1%內皮細胞生長添加物和1%青霉素/鏈霉素溶液。置于37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
消化（10cm皿為例）：
當單層培養(yǎng)細胞匯合達80%。
棄去舊培養(yǎng)基，2mlPBS潤洗兩次。
用1ml含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培養(yǎng)箱放1min，然后鏡下觀察變圓）。
用1ml（血清）細胞培養(yǎng)基終止消化，九宮格法吹落細胞收集到離心管，以800-1000rpm，室溫離心5min。
傳代：
以1:2~1:3的比例傳代，離心棄去廢液，用2ml~3ml（血清）細胞培養(yǎng)基充分重懸細胞沉淀成單個細胞，以“"Z“"字打入含有7ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中，輕柔十字晃勻不超過十下并靜置數(shù)分鐘后鏡下觀察，平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱中。
凍存：
凍存液的配置為血清：二甲基亞砜(DMSO)=9:1。
取長勢良好，匯合度達80%-90%并無污染的細胞，消化離心后用1.5ml凍存液重懸后轉移至凍存管中，標記好細胞種類、日期、操作者，放入恢復室溫的梯度凍存盒，一同放置于-80°C冰箱。
復蘇：
準備好離心管中放入3ml（血清）細胞培養(yǎng)基，并確保水浴鍋打開并達到37°C，從-80°C冰箱取出目標凍存管，放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min，與3ml培養(yǎng)基混合均勻。在1000rpm，離心5分鐘，棄去上清液，用新培養(yǎng)基重懸細胞為單個細胞狀態(tài)，加入10cm皿中，培養(yǎng)過夜。
注意事項：
1.ECM細胞培養(yǎng)基又稱內皮細胞培養(yǎng)基，是專門為人類微血管內皮細胞體外培養(yǎng)設計的最合適其生長的（血清）細胞培養(yǎng)基，包括必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和低濃度胎牛血清（5%）。
2.該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進正常人類微血管內皮細胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長。
3.嘗試過使用DMEM（高糖）培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基，考慮可能由于不含生長因子，多代后細胞形態(tài)發(fā)生改變，碎片增多。
4.ECM細胞培養(yǎng)基中的數(shù)種成分是怕光的，所以推薦培養(yǎng)基不要長時間暴露在光中。避光4°C保存，配好的培養(yǎng)基需要在一個月內使用。
5.HCMEC/D3細胞十分耐造，正常培養(yǎng)即可。
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